丹酚酸B联合iPSCs-NSCs对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的修复作用及机制研究

摘要：目的 探讨丹酚酸B联合诱导多能干细胞来源的神经干细胞(iPSCs-NSCs)对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的修复作用,以及对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)表达的影响,并观察蛋白激酶B(Akt)信号传导通路在该过程中的作用. 方法 将诱导多能干细胞(iPSCs)诱导分化为神经干细胞(NSCs),并行巢蛋白(nestin)免疫荧光染色.(1)其后进一步诱导分化为神经元,并分为4组:常规培养基组、丹酚酸B组(加入丹酚酸B50 μmol/L)、丹酚酸B+GM6001组(加入丹酚酸B 50 μmol/L、GM6001 25 μmol/L)、丹酚酸B+LY294002组(加入丹酚酸B 50 μmol/L、LY294002 25 μmol/L).分化后细胞进行微管相关蛋白2(MAP2)免疫荧光染色和实时定量PCR检测,并采用Western blotting检测常规培养基组、丹酚酸B组、丹酚酸B+LY294002组MMP-2、pAkt和Akt表达.(2)48只大脑中动脉闭塞模型大鼠按随机数字表法分为3组:PBS空白组、iPSCs-NSCs组、丹酚酸B+iPSCs-NSCs组,分别于纹状体处局部注射PBS、iPSCs-NSCs及丹酚酸B.造模7、14d后应用Longa评分和SMA评分对各组大鼠神经功能进行评估;7d后采用免疫荧光染色检测nestin表达,14d后采用免疫荧光染色检测MAP2、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达;采用Western blotting检测各组MMP-2、TIMP-2表达. 结果 (1)与常规培养基组、丹酚酸B+GM6001组、丹酚酸B+LY294002组比较,丹酚酸B组神经元计数、MA P2 mRNA相对表达量明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05).与常规培养基组、丹酚酸B+LY294002组比较,丹酚酸B组MMP-2、pAkt/Akt表达明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)造模7、14d后,与PBS空白组、iPSCs-NSCs组比较,丹酚酸B+iPSCs-NSCs组Longa评分、SMA评分明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);14 d后,与iPSCs-NSCs组比较,丹酚酸B+iPSCs-NSCs组MAP2表达明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05);7、14d后,与PBS空白组比较,iPSCs-NSCs组、丹酚酸B+iPSCs-NSCs组MMP-2表达明显增高,TIMP-2表达明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 丹酚酸B可促进iPSCs-NSCs向神经元分化.移植iPSCs-NSCs可促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能恢复.丹酚酸B联合iPSCs-NSCs可通过Akt信号传导通路调节MMP-2/TIMP-2系统促进iPSCs-NSCs向神经元分化,从而进一步促进神经功能恢复.